久阪玄瑞在京都提出“大和御幸(大和皇家視察)、御親政”的《攘夷御親征》的建白書，8月13日在親長州派的公卿三條實美等大臣的盡力下，朝廷下達了該敕詔。但是與此同時幕府知道了擅自長州藩主持的激進攘夷派的舉動，於是和會津藩、薩摩藩、中川宮朝彥親王、其他公武合體派的公卿一起發動「八月十八日政變」，使得長州勢力遭到朝廷一掃而空，長州藩也被解除了宮門警衛的職責，而孝明天皇也發出了“支持攘夷，反對倒幕”的意見。而久阪玄瑞暫時以京都詰政務座的身份留在京都並且圖謀回覆失地。在此期間，三條實美、真木和泉和來島又兵衛等主張向京都進軍的“進發論”，但是久阪玄瑞和桂小五郎阻止了這一舉動。
第二年4月，久阪玄瑞想要乘薩摩藩的島津久光、福井藩的鬆平春嶽和宇和島藩的伊達宗城離開京都的機會，讓長州藩的世子毛利定廣上京。
但是翌年的元治元年(1864年)6月5日(以下時間均爲舊曆)，池田屋事件的悲劇傳到國內造成藩內向京都進攻的意見開始沸騰，久阪玄瑞在無法控制過熱的藩內輿論下，不得已來島又兵衛與真木和泉一起率領諸隊東上，參與舉兵。益田親施、久阪玄瑞等人在山崎天王山、寶山，國司親相、來島又兵衛等人在嵯峨天龍寺，福原元僴在伏見長州屋敷集兵、佈陣、紮營。24日他起草了《嘆願書》，引起各藩志士和朝廷中不少公卿的同情，但是7月12日薩摩藩的士兵到達京都後局勢一下子發生了變化。
最終在7月18日，久阪玄瑞在男山八幡宮(石清水八幡神社)的本陣和20多名主要幹部召開了最後的大會。久阪玄瑞堅持不應該違背朝廷的命令率兵進發，但是來島又兵衛斥責道：“進軍有什麼可以猶豫的?”久阪玄瑞回答說：“這件事本來是爲了洗刷君主無實的罪名，應該多次重申我們的請求。我們一開始就不想戰鬥。而且世子君馬上就要來了，等一等他在決定要不要進攻比較合適。現在，我軍進攻的話，不但沒有援軍，而且我軍的準備也不充分，爲了必勝，我們還是等到時機成熟再做了斷比較好。”來島又兵衛則呵斥道：“卑怯者”、“我就知道你這醫生小子會拒絕。如果吝惜自己的性命而猶豫的話，就隨便留在此處好了。其他的人助我一臂之力，消滅惡人!”之後離座而去。最年長的參謀的真木和泉也說“我同意來島君的意見”，決定進攻。久阪玄瑞一言不發的離開座位回到天王山的本陣去了。
各藩增援京都的兵力有2萬到3萬，而長州藩只有不到兩千人，因此這對長州藩來說是極大的挑戰。
7月19日，來島又兵衛率先領兵進攻蛤御門，結果指揮來島又兵衛率部與會津藩的士兵交火的時候遭到薩摩藩士兵的夾擊，來島又兵衛遭到西鄉隆盛指揮的部隊的狙擊而負傷，接着自殺身亡。來島隊的士兵頓時兵敗如山倒。
雖然不情願，但是久阪玄瑞還是真木和泉等人一起支援來島又兵衛，但是由於來遲了一步，久阪玄瑞想要再度通過鷹司輔熙向朝廷發出申請書，於是率部向鷹司邸附近的堺町御門發動進攻，因爲無法擊敗守衛大門的越前藩的軍隊，於是率領部隊翻牆進入鷹司輔熙邸內，久阪玄瑞親自請求鷹司輔熙再次幫助自己提交嘆願書(申請書)，但是遭到了拒絕，接着鷹司輔熙從久阪玄瑞手中掙脫逃走了。接着越前藩的士兵從會津藩手中借來了大炮轟擊，長州藩的士兵開始四下潰散。在鷹司輔熙邸起火後，久阪玄瑞勸阻想要和他一起自殺的入江九一，“無論如何也要逃出重圍，報告給世子君，讓他不要接近京都。”但是入江九一剛從鷹司輔熙邸逃出來的時候，就被越前藩的士兵發現，一槍戳在臉上死去了。
最後留在鷹司邸內的久阪玄瑞和寺島忠三郎一起互刺自殺身亡。享年25歲。
久阪玄瑞死後，因爲發生大火，遺體最終也沒得到確認。入江九一則和其他8名戰死在鷹司邸附近的長州藩藩士一起，在獲得鬆平春嶽的許可下，被安葬在福井藩在京都的墓葬——上善寺，據說久阪玄瑞在也其中。
久阪玄瑞和妻子文之間沒有孩子。因此他的連襟小田村伊之助將他和前妻壽(文的姐姐)之間的次子粂次郎過繼給他作爲養子，玄瑞死後粂次郎繼承了久阪家。但是玄瑞在京都的時候和藝妓之間有了一個遺腹子，在明治維新後，這個孩子被承認了，被起名叫做秀次郎，繼承了久阪家。後來在大倉組的臺灣基隆支社工作。現在我們所熟知的久阪玄瑞的畫像就是以秀次郎爲原型所描繪的。
小田村伊之助此時改名爲楫取素彥，而粂次郎則取名楫取道明，又回到並繼承了楫取家。後來道明在臺灣芝山岩事件中遭到殺害、作爲「六氏先生」的一員被祭祀。道明的生母壽死後，他的父親素彥和文再婚。
