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於定國，字曼倩，東海郡郯縣人。
他的父親於公曾任縣獄史、郡決曹等官職，於公在獄史一職時，東海郡有一個婦女年紀輕輕就守了寡，沒有孩子，對婆婆很是孝順，婆婆心疼她讓她改嫁卻被她拒絕，後來老太太爲了不再拖累媳婦竟自縊身亡，但婆婆的女兒卻將寡婦告上了官府說是她害死了自己的母親，寡婦被抓後申辯未果，被屈打成招。於公看了案卷後覺得這個寡婦不是殺害婆婆的兇手，但太守卻不同意於公的看法沒有釋放寡婦，於公見說服不了太守抱着卷宗在郡府大哭起來，之後又辭去官職，不久後寡婦被處死。寡婦死後，郡中大旱了三年。後來新太守上任後在於公的幫助下替寡婦洗清了冤屈。這件事情過後，於公也深受當地百姓的愛戴，後來郡中的老百姓爲他立了生祠，稱作於公祠。
於定國從小也耳濡目染，從小跟着父親學習律法，治獄嚴謹。他任過獄史、郡決曹等官職，之後補廷尉史，並被推選與御史中丞從事辦理謀反者的獄案，在一次事件中他才智出衆斷案精準升爲侍御史，又升任御史中丞。御史中丞是古代御史臺的高官,僅次於御史大夫,相當於現在的國家檢察長的官職。元平元年，劉賀接受皇帝璽綬，承襲皇帝的尊號，繼位之後的劉賀不僅行狂亂之事，還把自己的從昌邑封地帶來人全部安插到朝廷重要部隊。包括給劉賀親下璽書的太后，劉賀對太后居住的長樂宮進行更換守衛。很多大臣都敢怒不敢言，於定國冒死上書規諫，力陳劉賀的荒唐行徑。大將軍霍光毅然決然地將他廢掉，擁立劉詢爲帝，這就是後來被稱爲中興之主的漢宣帝。
漢宣帝劉詢即位後大將軍霍光兼任尚書事，在霍光的舉薦下於定國破格升爲光祿大夫，備受重用，幾年後又任命爲廷尉。廷尉位列九卿，爲中央最高司法審判機構長官，彙總全國斷獄數，主管詔獄和修訂律令的有關事宜。在於定國擔任廷尉的十多年中，他始終一視同仁，十分審慎地處理，不畏強權，爲實現“天下無冤”進行了不懈的努力，贏得了朝廷上下的稱讚。
漢宣帝甘露二年，於定國任御史大夫，位列三公。漢元帝即位後，關東連年遭受災害，百姓流離失所，有人進言應把責任推到大臣身上，於定國作爲丞相上書請罪主動承擔了執法不力的責任，正好乘着這股東風，更加加大了執法力度。使得當時的社會環境大有好轉。永光元年，於定國託病辭官回鄉，元帝便賜給他四匹馬拉的可以坐乘的車、黃金六十斤，罷官歸家。最後於定國逝世時年享七十多歲，諡號安侯。
