下關條約
恰在同時，長州藩遭到了英美法荷四國聯合艦隊的報復性攻擊。聯合艦隊由英國東洋艦隊司令庫巴指揮，共有17艘軍艦，配備有288門大炮和5019名士兵，還有3艘聯絡船。9月5日，艦隊開始攻擊下關，猛轟了三天，摧毀了全部炮臺。長州軍隊雖然頑強戰鬥，但終因實力懸殊而失敗。這一事件，是“長州政策上的，甚至日本歷史上的一個轉折點”。9日，長州藩主派高杉晉作化名宋戶刑馬家老充任講和使者，前往聯合艦隊與庫巴簽定了放棄攘夷的“下關條約”。
第一次徵長戰役
8月24日，幕府爲了追究長州兵在“禁門之變”中進攻京都皇宮的責任，取得討伐長州藩的敕令，便通知各藩出兵。討伐軍由御三家之一尾張藩主德川慶勝率領，共計6藩15萬兵力準備討伐長州。然而各藩苦於財政困難，對幕府恢復參覲交代制懷抱反感，因而並無戰意，軍隊行動遲緩。討伐軍參謀、薩摩藩士西鄉隆盛提出了假長州人之手處分長州激進派這種妥協方案作爲解決辦法。12月9日，長州藩保守派將三名攘夷派家老切腹以示“恭順投降”。第一次徵長戰役就這樣結束了。
長州藩在內外攻擊下屈服於幕府，保守派掌握了藩政，並下令解散諸隊和懲處尊攘派志士，使長州藩剛剛形成的尊攘勢力受到嚴重打擊。晉作爲躲避迫害，遂化名谷梅之助從家裏潛行至九州筑前藩的維新女士野村望東尼的平尾山莊隱蔽。長州藩倒幕勢力在艱難困苦的環境中不僅沒有解散，反而團結內部，加強軍事訓練，準備同幕府進行最後的決戰。
以武力奪取藩政權
正當長州藩倒幕勢力力量處於困難之機，亡命於筑前的高杉晉作決心以武力奪取藩政權，並與幕府鬥爭到底。於是，他潛回下關，祕密聯絡諸隊佈置起兵。1865年1月14日，晉作在下關功山寺舉兵。他列舉藩內保守派奸吏的罪惡，呼籲人民羣衆爲國誠心協力，挽救國難。下關舉兵受到豪農豪商的熱烈支持，他們組織了“莊屋同盟”，發誓要組織農民起義，並給予大量財力物力上的幫助。1月28日，晉作動員伊藤博文的力士隊迅速攻佔了下關伊崎會所，奪取了大量軍費和武器彈藥。2月1日，晉作發表“討奸檄”，率部與保守派軍隊決戰於繪堂，一舉奪取了藩政權。
繼續實施“富國強兵”政策
倒幕派掌權後，晉作曾準備出國考察西方富國強兵的經驗，但長崎的英國軍火商古拉伯勸他此時不宜出國，應該留下倡導開港，那樣長州藩就可以從英國獲得大量新式武器，晉作深以爲是。高杉晉作指出，應該在不辱國體的條件下開下關港，只有這樣才能割據富國。否則，就不僅趕不上幕府和薩摩藩的實力，還會最終陷入外夷妖術。於是，他便留在藩內處理軍國大事。從10月到12月，他先後擔任了藩內的“用所役國政方”(政務機關的長官)，“海軍興隆用掛”(負責海軍建設的官職)，下關“越荷方頭人座” (對北陸道所屬7個藩國運來的貨物進行收購的機構的官員)和下關“伊崎新地都合役”(行政官職)。1867年7月,他又擔任過海軍提督(司令)。晉作等人在“富國強兵”、“殖產興業”、“開港貿易”的近代化方針指導下，實行了一系列的政治、經濟和軍事方面的改革。如破除封建門閥和身份制度，不拘一格選拔人材;改革軍事制度，實行軍備近代化;大搞開港貿易，發展工業等等，使長州藩作爲“割據倒幕”基地而日益鞏固和發展。
第二次徵長戰役
慶應2年(1866年)1月21日(有一說是1月22日)，在土佐藩的阪本龍馬、中岡慎太郎、土方久元的仲介下，晉作和桂小五郎、井上聞多、伊藤俊輔(伊藤博文)一起在京都和薩摩藩組成薩長盟約。
5月時，與伊藤俊輔一起被命令前往薩摩，並且在長崎單獨買下了新式戰艦“丙辰丸”。
1866年6月，在反擊幕府發動的第二次徵長戰役中，晉作身爲全藩軍事統帥，併兼任海軍總督，冒着槍林彈雨乘軍艦“丙辰丸”親自指揮並參加了大島和小倉反擊戰，擊退幕府艦隊，奪回了周防大島，使長州藩方面取得徹底勝利。在戰場上，這位英雄曾吟詩一首：“赫赫東藩八萬兵，襲來屯在浪華城，我曹快死果何日，笑待四鄰聞炮聲。”從詩裏可以想象出他當年指揮自若的情景。
當明治維新的勝利曙光依稀在望之時，在櫻山療養的高杉晉作因肺結核於應慶三年4月14日(1867年5月17日)逝世於下關新地，遺命葬在奇兵隊駐地吉田，時年不足28歲。未說完的辭世之句爲“おもしろき こともなき世を おもしろく”(讓這無趣的世界變得有趣吧)
有人認爲，“爲何如此啊?異常的世間!只因他騎馬，反覺馬瞼圓”這首歌是戲弄高杉的。硬將其容貌和他的歷史作用聯繫在一起，的確耐人尋味。
在明治維新歷史長卷中，高杉晉作是一位值得重視的英雄人物。其政治生涯是短暫的，但卻有聲有色，威武雄壯，處處是驚濤回瀾。在幕末各種政治力量重新組合的過程中，他勤於學習，長於思考，往往未雨綢繆，機智縱橫。概觀高杉晉作一生，雖有不足，但其思想在不斷地向前發展並日趨成熟。其理論和實踐始終是與時代變革的脈搏一致的，不愧維新先驅者的稱號。
後因木戶孝允(桂小五郎)和大村益次郎等人要求，晉作被接入靖國神社與其他革命先驅一同接受表彰和祭拜。
有說晉作曾於1866年作都々逸“三千世界の鴉を殺し、ぬしと朝寢がしてみたい”(三千世界鴉殺盡，與君朝寢到天明)給木戶孝允。
伊藤博文在他的彰顯碑上寫道：“如果要能動如雷電、發如風雨，使衆目駭然，無能夠正視者。我則比不上東行高杉君”
有人用“仰天大笑出門去，我輩豈是蓬蒿人”來評價他;因爲高杉晉作愛酒愛美人，也有人評價他爲“醉臥美人膝，醒握天下權”。
