公元前333年8月底，亞力山大征服小亞細亞腹地以後，立刻南下進軍波斯帝國在小亞細亞最後的據點西里西亞(Cilicia)。波斯西里西亞總督阿薩姆(Arsames)繼續誘敵深入，棄守金牛山脈上的險要山口，使得馬其頓大軍輕易進佔首府塔蘇斯(Tarsus)。與此同時，波斯王大流士親率數十萬大軍從巴比倫出發，於9月初到達阿曼山脈東側的索克依(Sochoi)嚴陣以待，打算利用這裏的平原地形同亞力山大決戰。
波斯行省西里西亞位於安納托利亞半島東南角，是小亞細亞進入兩河平原的門戶，這裏有金牛山脈(Taurus Mountains)環繞西、北兩面，東面是南北走向的阿曼山脈(Amanus Ranges)，山脈以東就是廣袤的兩河平原。阿曼山脈阻斷了東西方向的交通，只有兩個山口能夠通行，一個是阿曼山口(Amanic Gate)，位於山脈北部的伊蘇斯河谷(Issus Valley)附近，另一個是敘利亞山口(Syrian Gate)，在阿曼山口南面約100公里處。亞力山大到達西里西亞以後感染風寒臥牀不起，修養了一個多月才復元。他派帕馬尼奧率部南進，控制敘利亞山口，並打探波斯軍隊的動向。帕馬尼奧軍團在敘利亞山口西側紮營，派出探馬越過敘利亞山口向東偵查，很快發現駐紮在索克依的波斯大軍。
亞力山大一向有料敵之先的能力，他接到帕馬尼奧的探報，斷定大流士將從南邊的敘利亞山口通過。10月底，亞力山大將傷病員留在依蘇斯的營地裏，率領大部隊向南行軍60公里來到敘利亞山口，準備在這裏利用地形阻擊大流士的大軍。正當亞力山大向敘利亞山口進軍時，大流士卻從索克依揮師北上，從阿曼山口順利通過，佔領了亞力山大留在伊蘇斯的大營，俘虜了所有的傷兵員和物資，截斷了亞力山大的後路。大流士將馬其頓的傷病員全部剁去雙手，放他們前去給亞力山大報信，然後從伊蘇斯南進20公里，到皮納羅河畔(Pinarus River)安營紮寨，嚴陣以待。伊蘇斯戰役就這樣以亞力山大陷入絕境拉開序幕。
西方史學家考證，皮納羅河就是今天的帕亞斯河(Payas River)。這條河發源於阿曼山脈，全長大約四公里，上游一公里多的河段在山谷中穿行;進入海岸平原最初的500米只能算是一條溪流;中游將近兩公里的河段加寬到35米，河牀上石頭密佈，河岸由於山洪沖刷而高聳陡峭，只有幾處平緩地段可以涉渡;下游入海的500米河段比較平坦開闊。根據亞力山大的史官卡利斯蒂尼(Callisthenes)的記錄，皮納羅河谷平原的寬度不超過2.5公里，即使加上可以部署兵力的一段平緩山坡，整個戰場的寬度不會超過三公里(現在的帕亞斯河谷平原寬3.5公里)。古典史料記載，大流士乘坐黃金打造的華麗戰車高居波斯陣線中央，從戰場上的任何位置都能看到他魁梧的身影。大流士身邊簇擁着2千騎兵禁衛軍，前面排列3萬希臘僱傭軍，組成中央陣營。由於戰場狹窄，希臘僱傭軍密集方陣的縱深達到24行。左翼陣營由4萬的卡爾達克步兵和2萬弓箭手組成，弓箭手部署在步兵方陣的後面。大流士特別派遣2萬步兵在皮納羅河以南依山列陣，對馬其頓軍隊的右翼形成包抄之勢。波斯右翼有2萬卡爾達克步兵壓陣，而事先渡河擔任屏障的3萬波斯騎兵在部署完畢以後全部退到右翼，佔據皮納羅河的下游河段。波斯騎兵統帥是納巴扎尼(Nabarzanes)，他麾下的6千鐵甲騎兵是大流士寄予厚望的突擊部隊。這樣波斯軍隊在第一道防線總共部署15萬人，在波斯陣線後面，還有數量不詳的藩邦部隊組成的第二道防線。
大流士的排兵佈陣相當精明，唯一的敗筆大概是將2千馬迪亞(Mardian)弓箭手部署在波斯左翼重裝步兵的前面。馬迪亞人是來自伊朗高原西南部的遊牧民族，以其優秀的弓箭手聞名波斯帝國。大流士這樣佈置大概是爲了充分發揮馬迪亞弓箭手快速準確的直射火力，以阻擊馬其頓騎兵的衝鋒，但他顯然高估了弓箭對馬其頓重騎兵的殺傷力。輕裝的馬迪亞弓箭手根本不具備抗衝擊能力，而他們身後的卡爾達克重裝步兵排列成希臘風格的密集陣，並沒有留下足夠開闊的通道給弓箭手後撤。這個弱點將導致波斯左翼的崩潰。
後世史學家大多認爲波斯軍隊的數量被過分誇大了。大流士的貼身衛隊2千人應該沒有水分;希臘僱傭軍佔據的陣線寬度不足一公里，按照24行的密集陣厚度計算，實際兵力應該不超過2萬人。同樣道理，左翼4萬卡爾達克步兵和2萬弓箭手實際兵力至少應該減半，即總共3萬人。右翼波斯騎兵佔據的戰場寬度只有500米，無論如何容不下3萬騎兵，後人估計參戰的波斯騎兵最多不過一萬人，其中至少一半是鐵甲騎兵。這樣估算波斯軍隊的一線兵力大約有7萬人。
在大流士調兵遣將的同時，馬其頓軍隊繼續穩步前進，各個部隊在行進當中按部就班進入指定的陣線位置。左翼陣營是帕米尼奧率領的馬其頓密集陣共1萬2千重裝步兵，由6個團級方陣組成，指揮官分別是帕米尼奧之子尼卡諾(Nicanor)、科恩(Coenus)、柏蒂卡(Perdiccas)、美利格(Meleager)、托勒密(Ptolemy)、和阿銘塔(Amyntas)。密集陣最初是32行縱深，隨着戰場的變寬而不斷向兩翼展開，厚度先減爲16行，再減爲8行，以保持足夠的正面寬度。密集陣前面是2千色雷斯標槍手和克里特弓箭手混編組成的散兵線，左邊有600希臘聯盟重騎兵保護側翼。亞力山大照例親率2千近衛騎兵組成右翼主力，左側是3千近衛步兵銜接馬其頓密集陣，右側是1,800特薩利重騎兵和800馬其頓輕騎兵，右翼遠端是2千希臘聯盟遊擊步兵和3千阿格里亞和色雷斯標槍手。亞力山大把希臘聯盟重裝步兵4千人作爲預備隊，大概是考慮到波斯軍隊裏希臘僱傭軍數量衆多，害怕自己的希臘部隊面對同胞不忍下手。此役馬其頓參戰部隊總共3萬2千人。
大流士佈陣完畢，擔任屏障的波斯騎兵迅速撤回本陣，亞力山大終於看到了波斯陣線的全貌。顯然大流士和亞力山大英雄所見略同，兵力部署都是左弱右強，突擊部隊都放在右翼。馬其頓密集陣面對波斯希臘僱傭軍和卡爾達克步兵，處於一比三的兵力劣勢，但波斯軍隊顯然打算在這裏取守勢，他們在皮納羅河北岸容易涉渡的地段埋置大量削尖的樹樁，用於阻礙馬其頓重裝步兵的衝鋒。這種缺乏信心的表現讓馬其頓步兵士氣更加旺盛。馬其頓密集陣的左側是2千標槍手和弓箭手，以及600希臘重騎兵，他們面對波斯最精銳的部隊 - 納巴扎尼統帥的鐵甲騎兵，實力對比非常懸殊。波斯左翼的2萬卡爾達克重裝步兵和1萬弓箭手將接受馬其頓近衛騎兵的考驗，他們的任務是儘量抵擋和遲滯馬其頓騎兵的突擊。在馬其頓陣線右側山坡上還有數千波斯步兵，威脅着馬其頓右翼陣線的側後方。
亞力山大看到馬其頓的左翼遠端過於薄弱，立刻將右翼的1,800特薩利重騎兵調到左翼。這裏亞力山大展現了高超的指揮藝術，他命令特薩利騎兵悄無聲息地貼着馬其頓密集陣的後面向左移動，大流士的視線被豎立如林的馬其頓長矛遮擋，對這個調動毫無察覺。亞力山大並沒有把特薩利騎兵部署在馬其頓密集陣的左側，而是讓他們藏在方陣後面作爲一支奇兵，接受帕米尼奧的指揮。這支奇兵在戰役當中起到了非常關鍵的作用。接下來亞力山大派出兩個營的近衛騎兵600人，在2千遊擊步兵和1千標槍手的支持下向右側山坡上的波斯步兵發起攻擊，以消除他們對馬其頓側翼的威脅。經過短暫的戰鬥，波斯步兵被迫放棄緩坡上的陣地，遠遠退到山麓之上。亞力山大隨後派遣300輕騎兵留在山坡上監視警戒，將其他部隊撤回本陣。
當馬其頓軍隊前進到波斯軍隊的弓箭射程之外時，亞力山大下令部隊原地稍息。他照例策馬馳過馬其頓陣線檢閱部隊，慷慨激昂地發表演說鼓舞士氣。與此同時，波斯軍隊的將領們也在陣前向他們各自的部隊大聲訓話，進行戰前動員，各種語言的呼喊聲此起彼伏，在河谷中迴盪。馬其頓將士羣情激昂，發出驚天動地的“戰吼”(War Cry)，波斯陣營不甘示弱，也以海嘯般的吼叫回應，而數千面波斯戰鼓開始擂響，震耳欲聾。伊蘇斯戰役一觸即發。
